Concentración de ADN por A260
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Resultados de biología y laboratorio
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Desglose de la fórmula
Fórmula
C (µg/mL) = A260 × 50 × dilution factor (dsDNA, 1 cm path)= 650
Nota
Modelo simplificado: estos resultados usan las relaciones de laboratorio estándar y constantes promedio (A260 = 1 para 50 µg/mL de ADN bicatenario, 617,96 g/mol por par de bases, ~110 Da por aminoácido, crecimiento exponencial ideal). Las muestras reales varían según la pureza, los contaminantes, el tampón, la temperatura y la calibración del instrumento. Verifique siempre con sus propios estándares y protocolo; no lo use con fines diagnósticos ni críticos para la seguridad.
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¿Qué mide realmente la lectura A260?+
A260 es la absorbancia de luz ultravioleta a 260 nanómetros, la longitud de onda a la que las bases púricas y pirimidínicas de los ácidos nucleicos absorben con mayor intensidad. Como la absorbancia es proporcional a la concentración (ley de Beer-Lambert), se usa como indicador de la cantidad de ácido nucleico presente en la muestra.
¿Cuál es el factor de conversión para el ADN de doble cadena?+
Una lectura de A260 de 1,0 corresponde aproximadamente a 50 microgramos por mililitro de ADN de doble cadena, así que la concentración es igual a A260 x 50 x factor de dilución. Esta constante es distinta para el ADN de cadena simple (alrededor de 33) y el ARN (alrededor de 40), así que asegúrate de usar la correcta según el tipo de muestra.
¿Por qué debo tener en cuenta el factor de dilución y la longitud del paso óptico?+
Si la muestra se diluyó antes de la lectura, o si el paso óptico de la cubeta o del instrumento no es exactamente de 1 cm, la absorbancia bruta debe corregirse antes de aplicar la fórmula de concentración, de lo contrario el resultado quedará desviado por ese mismo factor. La mayoría de los espectrofotómetros modernos normalizan automáticamente a un paso de 1 cm, pero vale la pena confirmarlo.
¿Qué me indica la relación A260/A280 sobre la pureza de la muestra?+
Una relación cercana a 1,8 indica ADN de doble cadena relativamente puro, mientras que una relación cercana a 2,0 se espera para ARN puro; una relación notablemente más baja sugiere contaminación con proteína o fenol, que absorben fuertemente cerca de 280 nm.
¿Por qué una muestra de baja concentración da una lectura poco fiable?+
Por debajo de aproximadamente 2 microgramos por mililitro, las lecturas de absorbancia quedan dominadas por el ruido del instrumento y la relación de Beer-Lambert se vuelve menos lineal, así que las concentraciones cercanas o inferiores a ese umbral deben tratarse como aproximadas, y un ensayo basado en fluorescencia es más fiable a concentraciones muy bajas.